随着毛细管电泳技术在抗体药物和其他蛋白类药物的检测中大量使用，其中很多方法已经成为多国药典中的标准方法，毛细管电泳已经在全球范围内被广泛应用到药品研发和质量控制环节。为广大制药企业提供在线自动、高效的蛋白分离检测解决方法。
传统电泳技术如SDS-PAGE和IEF是生物制药企业产品放行测试的老方法。然而这些平板凝胶的方法极为不便，并且使用有毒的试剂，分析物检测使用的染色和脱色步骤不稳定性导致有效迁移率的变化和重现性较差。许多生物制药企业如Genentech、Amgen、Pfizer和EliLilly等均寻求CE的方法替代平板凝胶的方法，如毛细管凝胶电泳（CE-SDS）、毛细管等电聚焦（cIEF）和毛细管区带电泳（CZE）。
另外随着CE厂家开发了友好、符合CFR21Part11的操作软件和应对多种蛋白、单克隆抗体分析的试剂盒，使CE成为了质量控制部门进行治疗性蛋白药物放行的良好替代品。这些规范是商业药物放行的一个组成部分。
毛细管电泳技术在蛋白药物分析中扮演了多种的角色，不仅有常见的CE-SDS方法，还会涉及测量药物产品的安全性、定性、纯度和成分分析等方法。是蛋白药物分析中的全能选手。
本文将介绍三个使用CE技术进行治疗性蛋白药物分析的常见应用。
1、CE-SDS进行蛋白质量和异质性分析
SDS-PAGE方法是生物药生产厂家常规进行一致性评价和估算蛋白分子量的方法，而CE-SDS作为一个稳定性的方法可以替代传统的SDS-PAGE方法。相较于SDS-PAGE，CE-SDS可以提供自动、直接、在线的UV或LIF检测，针对于蛋白的准确定量和分子量测定提供更高的分辨率和重现性。当前，线性或稍有分支的聚合物例如线性聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、聚乙二醇、葡聚糖和支链淀粉，均可用作筛分介质用于CE-SDS实验。相较于交叉结合的聚丙烯酰胺筛分介质，这些聚合物的可溶于水和可替换等特性均提高了CE-SDS分析的多样性，并且提升了整体的精密度和稳定性。
值得说明的是，CE-SDS比基于大小分离的高效空间排阻色谱（HPSEC）和SDS-PAGE具有更高的分离度，尤其针对于质量相近的异构体。CE-SDS具有多种模式的运行，包括还原和非还原样品的分离，每一种模式都为QC系统提供了更多的样品信息。对于非还原样品处理的实验，CE-SDS可以提供10-kD的蛋白片段的分离能力，可以共同检测完整蛋白或可能存在的聚体。对于单克隆抗体和蛋白类似物的放行和稳定性，这种范围较宽的分离效率使得CE-SDS成为监测完整的蛋白与片段比例的理想工具。
图1（下）展示了天然的r-MAB的CE-SDS电泳图谱，并且可从图谱中观察到完整蛋白和单克隆抗体常见的片段杂质。从图1（上）可以看到还原实验中非糖基化的重链可以基线分离，有利于对其进行准确、可靠的定量。
图1还原（上）和非还原（下）IgG标准品的分析。峰的识别：1.内标（10kDa）2.轻链（LC）；3.非糖基化重链（NG）；4.重链（HC）；6.重链（2H）；7.2重1轻链（2H1L）；8.NGHC；9.IgG单体
常规样品前处理都需要经过高温处理（例如90℃），实现蛋白与SDS的结合。在非还原的CE-SDS中，高温引起的二硫键断裂和交换反应可能会导致更多的蛋白片段。这些人工导致的杂质片段会改变蛋白大小异构体的准确含量，也会增加CE-SDS方法学进行非还原实验时定量的不稳定性。因此，不仅需要优化毛细管电泳条件，而且投入大量的精力来规定正确的样品制备条件是至关重要的。
大部分的CE-SDS应用都是利用UV检测器，如图1，与考马斯染色的灵敏度保持一致。然而，一些大的药企，如Genentech，利用激光诱导荧光检测器（LIF）进行CE-SDS的实验。LIF检测器会带来两个比较重要的优势。
首先，LIF检测器能提供与银染一致的灵敏度，图2A和2B分别展示了CE-SDS-LIF进行还原和非还原实验的电泳图。用CE-SDS和LIF检测分析了痕量r-MAB异构体和过程中产生的杂质可达到低至50ppm的水平。
第二个优势是毛细管中填充的胶会不同程度的影响基线，从而影响蛋白异构体的积分。利用5-TAMRA.SE进行标记的LIF检测可明显降低胶带来的干扰，可达到倍的检测灵敏度的提升。
图2非还原（图2A，上）和还原的5-TAMARASE标记的单抗样品的CE-SDS分离。
2、毛细管等电聚焦进行电荷异构体的表征
法规机构对于生物药产品的电荷异构体需要进行良好的表征。重组蛋白产品的电荷异构体通常由翻译后修饰导致，如唾液酸化、磷酸化、去酰胺和C末端赖氨酸残基的增加等作用。这些电荷异构体经常使用离子交换色谱（IEC）进行评估，然而，IEC方法的开发通常针对范围较广或特定产品。
IEC的优化需要调节很多参数，如色谱柱、流动相组成、pH、盐离子、温度和梯度。而CE技术提供的cIEF和CZE方法可以提供更短的分析时间和针对于多种产品的固定方法，更加适用于当今治疗性蛋白快速发展的检测需求。
CZE模式中，样品根据不同的电场迁移率进行分离。因此，这项分离技术中也涉及到了样品大小的因素。cIEF模式中，会仅根据样品的电荷异构体进行分离。cIEF进行单克隆抗体的电荷异构体分离会展现更好的分离度，如图3
图3三个异构体组、7个标记的异构体峰用于单抗cIEF分离中间精密度的测试。标记为A到G的峰用于表征预估的等电点的差异和异构体群组百分比组成，用星号表示的峰用于估计异构体群组百分比组合的变化
cIEF同样作为一个蛋白纯度分析的方法，更主要因为可进行快速的方法开发和更高的重现性，已经成为了众多制药企业的选择的工具。cIEF通常会利用UV检测器进行在线检测。在毛细管中经过电荷异构体的聚焦后，利用电化学迁移的模式进行逐一检测。商业化的等电聚焦试剂盒不仅促进了方法开发，并且可以转移到产品质控。
3、CZE-LIF方法进行N端糖基的分析
糖基化，作为治疗性蛋白存在的众多翻译后修饰的过程之一，由于其在蛋白质功能上的作用而被广泛
转载请注明地址:http://www.1xbbk.net/jwbzn/557.html
